Tecniche ottiche

Tecniche ottiche

Tutte le tecniche d'analisi ottiche si basano sul fatto che tutte le sostanze sono composte da molecole che assorbono elettivamente alcune radiazioni di determinare lunghezze d'onda; questo assorbimento decresce gradualmente per quelle radiazioni di lunghezza d'onda più lunga o più corta di quelle maggiormente assorbite.

Il fenomeno dell'assorbimento delle radiazioni luminose per una soluzione dipende, in definitiva, dalla concentrazione delle molecole che costituiscono i centri di assorbimento della sostanza disciolta. Quanto maggiore è il numero di queste molecole, maggiore sarà l'assorbimento delle radiazioni incidenti.

Legge di Lambert - Beer

Il fenomeno dell'assorbimento della luce da parte delle soluzioni è definito in termini quantitativi dalla legge di Lambert - Beer.

Se una radiazione monocromatica passa attraverso una soluzione, l'assorbimento subito dalle radiazioni è direttamente proporzionale allo spessore ed alle concetrazini della soluzione stessa.

Le legge di L.-B. stabilisce il legame esistente tra l'intensità della luce che esce dalla soluzione e l'intensità della luce che l'ha colpita (trasmittanza), e tra quest'ultima e la concentrazione della sostanza assorbente, presente in soluzione (soluto

I/I₀ = T = e^-klc

Dove:

I: intensità della luce tramessa dalla soluzione.

I₀: è l'intensità della luce incidente.

T: trasmittanza.

l: spessore della soluzione attraversata dalla luce.

c: concentrazione della sostanza assorbente in soluzione.

k: coefficiente di estinzione molare (caratteristico per ogni sostanza ad una determinaa lungheza d'onda per un determinato solvente e per una determinata temperatura; in questo caso l'acqua).

Questa relazione è espressa graficamente come un'iperbole equilatera, ma possiamo linealizzarla con il logaritmo di T:

-logT = assorbanza (o densità ottica) = klc

Se l e c sono unitarie, la densità ottica corrisponde al coefficiente di estinzione molare. La densità ottica sarà del 100% quando tutta la luce incidente è assorbita; questa deve essere tra e

Quando ci si presta a fare nuove analisi, bisogna sempre controllare le giuste concentrazioni e la fonte d'emissione delle radiazioni.

Le tecniche ottiche principali si basano su questo principio e sono la fotometria e la spettrofotometria. Queste sono le misure dell'assorbimento da parte del materiale in esame di radiazioni luminose incidenti, di caratteristiche spettrali ben definite, in genere comprese tra e nm.

Per ogni sostanza, dunque, è possibile determinare uno spettro o curva d'assorbimento che, come ricordato prima, dipende dal numero delle molecole in esame; i picchi d'assorbimento possono essere anche doppi e multipli, nel qual caso si sceglie quello più intenso (cioè quello più alto).

L'analisi fotometrica diretta avviene quando si studiano sostanze che presentano uno spettro di assorbimento naturale come le porfirine e la bilirubina.

L'analisi fotometrica indiretta avviene quando si studiano sostanze che necessitano la trasformazione in un derivato fotoassorbente.

Spettrofotometria per i dosaggi enzimatici

Questa tecnica ci permette di studiare anche l'attività enzimatica, come quantità di substrato consumato o quantità di prodotto ottenuto.

Il NAD⁺ che diventa NADH produce un aumento di assorbanza a 340 nm e viceversa. Esistono vari esempi:

Piruvato + NADH + H⁺ Lattato + NAD⁺;

Si misura l'attività della LDH, registrando il decrmento di assorbanza a 340 nm, dato dall'ossidazione del NADH.

Chetoglutarato + Alanina Glutammato + Piruvato;

Piruvato + NADH + H⁺ Lattato + NAD⁺;

Il decremento di assorbanza fornito da NAD⁺ è funzione del substrato Piruvato presente, la cui concentrazione è funzione dell'attività transaminasica ALT

Creatinin-P + ADP ATP + Creatina;

Piruvato + ATP Fosfoenolpiruvato + ADP (mediante PK);

Piruvico + NADH + H⁺ Lattato + NAD⁺ (mediante LDH);

Si misura la quantità di Creatini-P presente nel siero di un paziente.

I fotometri servono per studi dell'assorbimento nella regione del visibile, mentre gli spettrofotometri permettono studi anche monocromatici e nell'infrarosso ed ultravioletto. Entrambi i due sistemi sono composti da:

Sorgente di luce policromatica.

Lente collimatrice.

Filtro o un monocromatore.

Cella o cuvetta di lettura.

Lente che focalizza la luce trasmessa su un sistema fotometrico.

Un sistema fotorilevatore.

Fluorimetria

Si basa sulla proprietà di alcune sostanze di assorbire energia di una data lunghezza d'onda e di emetterne una a lunghezza d'onda maggiore (fluorescenti). Se la sostanza da dosare non è florescente, la si marca, con, ad esempio, fluoresceina

Turbidimetria

È una tecnica che misura la luce assorbita da parte di un sistema eterogeneo, quale una soluzione colloidale o un precipitato finemente disperso.

Nefelometria

È adatta per lo studio di fasi finemente disperse o fini e si basa sullo studio della luce diffratta. È molto sensibile.

Fotometria d'emissione

Questa studia le radiazioni caratteristiche emesse dalle molecole, dagli ioni o dagli atomi, legati ai processi di eccitazione. È impiegata per o studio di concentrazioni di metalli alcalini (Na⁺ e K⁺). Per fotometria ad emissione a fiamma s'intende lo stesso procedimento ma con l'ausilio di una fiamma ossidante come energia termica per l'eccitazione del materiale da studiare.