Tecniche di laboratorio immunologico

TECNICHE DI LABORATORIO IMMUNOLOGICO

ANTICORPI MONOCLONALI

Anticorpi specifici per un solo antigene.

1. I linfociti B o le cellule spleniche di un animale immunizzato con un antigene vengono infusi con cellule di mieloma(tumore delle plasmacellule)continuamente replicanti. La linea mielomatosa a causa di una mutazione è priva di un enzima,l'ipoxantino-fosforibosil-transferasi(HPRT)necessario per il metabolismo delle purine e non produce e secerne immunoglobuline.
2. Le cellule si fondono grazie ad un'esposizione al glicole-polietilenico.
3. Tre popolazioni quindi rimangono in coltura:cellule spleniche,cellule mielomatose e ibridi.
4. Le cellule spleniche non fuse muoiono dopo pochi passaggi.
5. Le cellule mielomatose non fuse scompaiono quando poste in terreni HAT che contengono ipoxantina,aminopterina e timidina in quanto mancano dell'enzima HPRT che non le consente di attuare il metabolismo delle purine.
6. Le cellule fuse(ibridoma B) invece crescono e si duplicano rapidamente dal momento che i linf B normali forniscono l'HPRT. In questo modo è possibile ottenere la crescita selettiva degli ibridomi B.
7. E' poi possibile selezionare e clonare dall'ibridoma le cellule che producono anticorpi della specificità voluta(anticorpi monoclonali)

VACCINAZIONE

Processo attraverso cui viene evocata una risposta immunitaria nei confronti di un microbo.

Tipi di vaccini:

• Batteri vivi attenuati o uccisi stimolano risposta anticorpale
• Virus vivi attenuati stimolano risposta anticorpale e immunità cellulo-mediata
• Vaccini a subunità(antigeni microbici proteici) stimolano risposta anticorpale
• Vaccini coniugati(antigeni microbici polissaccaridici o lipidici associati a proteine) stimolano risposta anticorpale dipendente da linfociti T-Helper
• Vaccini sintetici(prodotti in laboratorio) stimolano risposta anticorpale
• Vettori virali(antigeni incorporati in vettori virali) stimolano risposte umorali e cellulo-mediate
• Vaccini a DNA(DNA che codifica per antigeni microbici all'interno di un plasmide batterico inoculato) stimolano risposte umorali e cellulo-mediate

REAZIONE LEUCOCITARIA MISTA (MLR)

Test predittivo di rigetto di allotrapianti in vitro in cui i linf T di un soggetto vengono coltivati in presenza dei leucociti di un altro individuo per studiarne le reazioni.

CROSS-MATCHING(abbinamento donatore-ricevente)

Test di screening in cui si mescola il siero del ricevente con i leucociti del potenziale donatore aggiungendo complemento e verificando se si verifica lisi delle cellule.In questo modo viene saggiata nel candidato al trapianto l'eventuale presenza di anticorpi preformati rivolti contro antigeni espressi sulla membrana delle cellule del donatore.

TRAPIANTO DI MIDOLLO OSSEO

Trapianto di tessuto midollare contenente cellule staminali che rigenera nel ricevente tutte le cellule ematiche mature e i linfociti.Il midollo osseo del ricevente deve essere completamente distrutto prima del trapianto in modo da liberare le nicchie in cui possa andare ad alloggiare il midollo trapiantato.Dal momento che il sistema immunitario risponde violentemente alle cellule midollari allogeniche,l'attecchimento del trapianto richiede che l'HLA dei due parners sia  compatibile.

Inoltre i linfT alloreattivi presenti nel midollo trapiantato possono attaccare i tessuti dell'ospite causando reazione del trapianto verso l'ospite(GVHD).

Il trapianto di midollo osseo è utilizzato per curare malattie del sistema emo-linfopoietico o per restaurare una funzione midollare danneggiata da trattamenti chemio- o radio-terapeutici anti-tumorali.

MALATTIA DEL TRAPIANTO VERSO L'OSPITE

Graft-versus-host disease

Malattia che si verifica nei riceventi di un trapianto di midollo osseo,provocata dalla risposta di linfociti T CD8+ maturi presenti nel trapianto verso gli alloantigeni espressi dalle cellule del ricevente.

Quadro clinico:rash cutanei(cute),diarrea severa(tratto gastrointestinale) e ittero(fegato).Questi tessuti sembrano essere particolarmente a rischio perché ricchi di antigeni di superficie DR.

ELISA(enzime linked immuno sorbent assay)

Metodo per la quantificazione di un antigene immobilizzato in fase solida utilizzando un anticorpo legato covalentemente ad un enzima.La quantità di anticorpo che si lega all'antigene è proporzionale alla quantità di antigene presente e si determina misurando mediante spettrofotometria la conversione da parte dell'enzima di un substrato incolore in una sostanza colorata.

FACS(fluorescence-activated cell sorter)

Separatore cellulare tramite sorting(classificare,smistare in generi diversi)derivato dal citometro a flusso,usato per la purificazione di certe cellule da una popolazione eterogenea in base alla loro capacità di legare una sonda fluorescente.

1. una sospensione cellulare viene isolata dal sangue o da altri tessuti e marcata con un anticorpo fluorescente.
2. le cellule sono forzate a passare sotto pressione attraverso una strozzatura in un getto liquido(soluzione fisiologica o acqua)
3. le vibrazioni sulla punta del boccaglio provocano trasformazione del getto liquido in una serie di goccioline di dimensioni tali da contenere una sola cellula.
4. le gocce vengono illuminate da un raggio laser monocromatico e monitorate elettronicamente da rilevatori di fluorescenza.
5. le gocce che emettono appropriati segnali fluorescenti diventano elettricamente cariche nel passaggio in un campo elettrico tra due placche ad alto voltaggio.
6. le gocce elettricamente cariche sono convogliate e quindi ordinate in tubi di raccolta ottenendo una accurata separazione cellulare. 

FORMAZIONE DI ROSETTE E

Metodica  per la determinazione dei linf T.

I linfociti T umani sono formalmente identificati dalla loro capacità di legarsi agli eritrociti di pecora (SRBC) per formare rosette,grazie al loro recettore CD2.

Tale metodica è stata abbandonata dopo l'introduzione degli anticorpi monoclinali che riconoscono il recettore CD2.

CITOFLUORIMETRIA DI FLUSSO

Tecnica per l'analisi dei fenotipi di popolazioni cellulari.Le sospensioni cellulari vengono incubate con anticorpi marcati con fluorocromo e la quantità di sonda che si lega alle singole cellule può essere valutata facendo passare le cellule una ad una attraverso un fluorimetro dotato di una sorgente laser a raggio incidente.