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Cromatografia




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CROMATOGRAFIA

TEORIA

Introduzione

La cromatografia è un metodo chimico-fisico di separazione che sfrutta la tendenza delle varie sostanze a distribuirsi, secondo determinati rapporti, tra due fasi distinte e separate, di cui una è fissa e l’altra è mobile.



Contrariamente ad altri metodi ottici di analisi nella cromatografia la separazione viene attuata. Le prime rivelazioni venivano fatte su composti colorati, oggi i metodi di rivelazione sono spesso basati sull’esame del colore delle sostanze separate o, per le sostanze incolori, sulle formazione di sostanze colorate, mediante l’impiego di opportuni reattivi chimici. La cromatografia si basa su principi diversi tra cui l’adsorbimento, la ripartizione, lo scambio ionico ecc. Le tecniche cromatografiche hanno la caratteristica comune di realizzare la separazione attraverso lo scorrimento di una fase mobile, contenente le sostanze da separare, su una fase fissa, che esercita un’ azione selettiva nei loro confronti.

Cromatografia analitica e preparativa

La cromatografia può essere condotta su scala analitica o su scala preparativa. Nel primo caso di opera su minime quantità di sostanza finalizzato per analisi qualitative o quantitative. Una volta separate, le sostanze sono perdute. Nel secondo caso lo scopo è quello di separare e raccogliere sostanze, da destinarsi all’utilizzazione in specifici settori (cosmetico ecc.)

Adsorbimento

All’interfaccia di alcune coppie di fasi, può stabilirsi un gradiente di concentrazione nella fase gassosa, in relazione al fatto che le molecole tendono ad addensarsi in prossimità di una fase (solido gas). Il fenomeno è detto adsorbimento ed è dovuto ad una particolare azione attrattiva che la fase esercita sulle molecole, trattenendole con legami chimici secondari, in corrispondenza dei centri attivi presenti all’interfaccia.

L’adsorbimento è originato da numerosi fattori:

a)   Struttura reticolare. I solidi adsorbenti presentano nel reticolo deformazioni in corrispondenza di atomi, le cui valenze non sono tutte saturate. Si stabiliscono dei legami deboli tra l’adsorbente e l’adsorbito.

b)   Stato fisico del solido adsorbente. I solidi adsorbenti devono trovarsi allo stato di grande suddivisione, in modo da presentare il maggior numero di centri attivi nel minor volume.

c)   Struttura molecolare dell’adsorbito. Le molecole che più facilmente vengono fissate sono quelle che presentano gruppi polari.

d)   Temperatura e pressione. La temperatura aumentando l’agitazione molecolare, tende a rompere i legami adsorbente/adsorbito e diminuisce la possibilità che se ne formino dei nuovi. La pressione invece aumenta la concentrazione dell’adsorbito sulla superficie dell’adsorbente.

L’adsorbimento è un fenomeno altamente selettivo; a parità di condizioni sostanze diverse risultano diversamente adsorbite. Trascinando queste sostanze su un certo percorso a contatto con la fase adsorbente, le sostanze più adsorbite impiegheranno tempi maggiori, rispetto alle altre. La selettività è legata alla natura dei gruppi polari presenti nelle molecole adsorbite e a parità di funzioni presenti, l’assorbimento aumenta con l’aumentare del peso molecolare.

Ripartizione

Molti processi cromatografici sono governati dalla legge di ripartizione di Nernst. Una sostanza a contatto con due solventi diversi X e Y, immiscibili tra loro, si distribuisce tra i due, in condizioni di equilibrio, secondo un rapporto K, coefficiente di ripartizione. Questo è anche un fenomeno selettivo, in quanto i valori di K variano da sostanza a sostanza. In cromatografia il processo si applica con minime quantità di sostanza ed è un processo continuo. Ciò è possibile sospingendo le sostanze da separare nel solvente X su un percorso dove vengono a contatto con il solvente Y. In questo modo le sostanze che risultano più solubili in Y avranno tempi di percorrenza maggiori rispetto alle altre e alla fine ne risulteranno separate. Durante la separazione le sostanze si distribuiscono secondo l’equazione di Nernst: CF = KCM Dove CF e CM rappresentano le concentrazioni rispettivamente nella fase fissa e nella fase mobile. L’equazione rappresenta, una legge limite che si discosta nella pratica a causa dei fenomeni di saturazione. Il comportamento è rappresentato dall’equazione di Langmuir:

A e B rappresentano le costanti empiriche. Entrambi le equazioni sono valide a temperatura costante perciò dette isoterme di ripartizione. La saturazione è funzione della temperatura di esercizio, che influenza il valore di K. Nel comportamento ideale la macchia è netta mentre nel comportamento reale la macchia è sfumata in relazioni ai sopra citati fenomeni di saturazione.

Scambio ionico

All’interfaccia tra una fase solida di natura polare (resina scambiatrice) ed una fase liquida contente ioni, può avvenire uno scambio di ioni. Il meccanismo dello scambio è regolato dal potenziale di scambio degli ioni interessati che corrisponde al coefficiente di attività dello ione. Esso influenzato da numerose variabili tra cui la concentrazione nella fase solida e nella fase liquida degli ioni da scambiare secondo l’equilibrio:

Spostato in un senso o nell’altro variando semplicemente il rapporto di concentrazione delle 2 specie ioniche. Il potenziale è strettamente legato alla carica dello ione, al numero atomico, alla massa ecc..; risulta un fenomeno selettivo, in quanto ioni diversi possiedono una diversa attitudine ad essere scambiati. Ciò rende possibile la separazione cromatografia.

Esclusione

Il principio dell’esclusione è di natura meccanica. La fase che esercita l’azione selettiva (fase fissa) è di natura porosa (gel), sul quale scorre la soluzione da separare. Le molecole di dimensioni minori penetrano nei micro-pori del gel, le molecole di dimensioni maggiori vengono allontanate dal solvente.

Una prima classificazione dei metodi cromatografici divide i metodi in relazione allo stato fisico della fase mobile. Secondo questo criterio i processi cromatografici vengono suddivisi in:

Processi in fase liquida. La fase mobile allo stato liquido viene a contatto con la fase fissa che è o solida o liquida.

Processi in fase gas. La fase mobile è 1 gas che passa attraverso la fase fissa sempre o  liquida o solida.



Una seconda classificazione tiene conto dei principi chimico-fisico di separazione: adsorbimento, ripartizione, scambio ionico, esclusione.

Una terza classificazione è in relazione all’attrezzatura utilizzata:

Colonna in vetro. Viene riempita con la fase fissa, la fase mobile è versata dall’alto e scende per gravità.

Foglio di carta porosa. Alimentato da una bacinella contenente il solvente.

Strato di materiale poroso su lastra alimentato da una bacinella contenente il solvente:

Foglio di carta imbevuta di solvente a due lati

Gascromatografo

Cromatografo in fase liquida ad alta pressione.

CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE

Cromatografia su carta

La carta è un intreccio di fibre cellulosiche da supporto per la fase fissa costituita da acqua o da altra fase polare. Il solvente (fase mobile) invade il foglio per capillarità, trasportando a distanze diverse le varie sostanze localizzandole tanto più lontano dal punto di partenza (linea base), quanto più basso è il loro coefficiente di ripartizione. Il dispositivo può essere ascendente o discendente a seconda del senso nel quale il solvente percorre il supporto cartaceo. Nella cromatografia ascendente il foglio di carta è sospeso mentre il solvente è posto in una bacinella collocata sul fondo della vasca entro la quale pesca il foglio di carta. Il miscuglio viene depositato nella parte inferiore del foglio, la fase mobile sale lungo il foglio, e solubilizza le sostanze trascinandole con sé verso l’alto. Le sostanze risaliranno il foglio con velocità diverse e quando il solvente avrà raggiunto l’estremo superiore, risulteranno disposte, secondo un ordine crescente dei loro coefficienti di ripartizione. Nella cromatografia discendente, la bacinella contenente il solvente è posta sulla sommità della vasca. La fase mobile scende in senso geometricamente inverso a quello del caso ascendente. Nella cromatografia orizzontale si usano dischi di carta disposti orizzontalmente, nei quali sia la sostanza da analizzare che il solvente vengono introdotti nel punto centrale del disco. La diffusione è di tipo radiale si ottengono cerchi concentrici invece di macchie.

Lo strato sottile

La cromatografia su strato sottile rappresenta una generalizzazione della cromatografia su carta. Questa tecnica ha trovato applicazioni su scala analitica, essa permette di estendere le tecniche della cromatografia su carta agli adsorbenti usati nella cromatografia su colonna. Essa inoltre risulta più efficace. In primo luogo non si è legati ad alcun tipo di supporto scelto liberamente tra i molti disponibili, la sensibilità aumenta e il tempo di eluizione risulta minore. La natura inorganica del supporto permette l’uso di rivelatori più energici, si può operare sia ad adsorbimento che ripartizione.


Tecnica analitica. Il materiale adsorbente è sotto forma di pasta e disteso su una lastra di vetro o di alluminio mediante stratificatore. Attualmente la sostanza più usata è il gel di silice. Le lastre vengono poste in stufa per l’essiccamento. L’applicazione del campione è condotta mediante una micropipetta o una microsiringa tarata in  microfiltri. Le lastre vengono collocate nella vasca contenente uno strato di alcuni mm di solvente, il quale percorre la lastra in senso ascendente.

Apparecchiature. L’attrezzatura essenziale per la TLC è la vasca in vetro o in acciaio inox, nella quale si immergono le lastre per lo sviluppo. Accanto a questo strumento si hanno alcuni importanti e costosi accessori quali: lo stratificatore, la lampada UV, il nebulizzatore, le microsiringhe.

Analisi su strato

Separazione

Si versa il solvente sul fondo della vasca per circa mezzo centimetro. Si ricopre la vasca con l’apposito coperchio a tenuta, per saturare l’interno con i vapori del solvente. Successivamente si pone la lastra in stufa a 110°C per circa un’ora, con la matita ,dopo, si traccia una riga sottile e leggera a circa 1 cm da un bordo della lastra, quindi il campione, sciolto viene depositato sulla linea di partenza mediante micropipetta o microsiringa. Si provoca l’essiccamento forzato del solvente con il fohn, occorre depositare più gocce e si evita di dover depositare delle gocce grosse che darebbero delle macchie molto larghe. La lastra allora, viene posta in posizione verticale. Si ricopre la vasca col coperchio per evitare l’evaporazione del solvente. Quando il fronte del solvente è arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore, si interrompe l’eluizione. Si toglie il coperchio e si estrae la lastra, si traccia completamente la linea di arrivo. Infine si pone la lastra in stufa ad essiccare per circa un’ora.

Rivelazione

Se tutte le sostanze sono incolori, occorre procedere alla loro rivelazione:

Si nebulizza tutta la lastra con un reattivo che reagendo con la sostanza porta alla formazione di composti colorati.



Si sottopone la lastra in camera oscura all’azione di raggi U.V. e con la matita si delimitano i contorni di ciascuna macchia in modo che saranno visibili alla luce naturale.

Successivamente si procede all’analisi qualitativa o quantitativa.

Analisi qualitativa

L’analisi qualitativa si basa sul fatto che il percorso di ciascuna macchia dipende dal coefficiente di ripartizione. Si misurano la distanza H della macchia ed S del fronte del solvente. Il rapporto H/S individua la posizione della macchia ed è comunemente chiamato Rf che costituisce una misura della velocità, dato principale per riconoscere le singole sostanze. I principali fattori che determinano Rf sono: il solvente della fase mobile, la temperatura di lavoro, la natura e le caratteristiche morfologiche della fase fissa. Questo valore è influenzato da variabili non facilmente controllabili che riducono del 3-4 % la ripetibilità e la riproducibilità. Perciò si ricorre all’uso di Rf relativi. Si unisce al campione una sostanza di riferimento ad Rf esattamente noto e appartenente alla stessa categoria. Gli Rf relativi delle singole sostanze saranno dati da:

I valori degli Rf per molte sostanze sono riportati in tabulati specializzati, ma per un riconoscimento più sicuro potrà essere effettuato calcolando l’ Rf  in laboratorio. Questo calcolo si realizza depositando una goccia di soluzione standard della sostanza da identificare sulla linea di partenza accanto alla sostanza incognita.

Analisi quantitativa

L’analisi quantitativa si basa sul principio per cui, tanto è maggiore l’intensità del calore di una macchia, tanto maggiore sarà la quantità di sostanza ivi presente. Il concetto è generalizzato anche all’ UV, anziché dell’intensità del colore si può parlare di assorbanza. Per le misure di essa si usano microfotometri o densitometri, che misurano anche la misura della radiazione che attraversa la lastra, effettuando una scansione. Si ottiene un cromatogramma composto da picchi corrispondente ad una sostanza. La quantità di sostanza presente è proporzionale all’area di picco.

Cromatografia bidimensionale

Nella separazione di miscugli complessi può accadere che due o più sostanze non risultino separate con un dato solvente X e che invece lo siano con il solvente Y. In questo caso si esegue dapprima un cromatogramma monodimensionale col solvente X nel modo già visto. Successivamente ruotando il foglio di 90° si esegue una nuova separazione con il solvente Y. L’identificazione avviene con il calcolo degli Rf, con la differenza che si avranno due serie di valori, una per il solvente X e una per l’Y di conseguenza ogni macchia sarà identificata da una coppia di valori di Rf.

Separazione monodimensionale di amminoacidi

Una miscela di amminoacidi può venire facilmente separata su carta e quindi rivelata con ninidrina. La soluzione in esame viene introdotta con una micropipetta sopra un foglio di carta per cromatografia e si lascia evaporare il solvente. Si sospende il foglio nella vasca, sul fondo della quale è posta la fase mobile butanolo-acqua. Il solvente sale per capillarità, trascinando verso l’alto i vari componenti. Quando il fronte ha raggiunto il limite il foglio viene estratto e si segna il punto di arrivo con la matita. Il foglio viene infine ,dopo essiccamento, spruzzato con ninidrina che farà apparire le macchie colorate. Si procede quindi al calcolo degli Rf. 

Separazione bidimensionale di amminoacidi Con la tecnica descritta non tutti gli amminoacidi possono venire separati. Si dovrà perciò ricorrere alla cromatografia bidimensionale che fornisce separazioni più nette. Un metodo efficace utilizza una miscela di butanolo, acido acetico e acqua. Terminata l’eluizione si asciuga la lastra, si ruota di 90° e la si immerge nel secondo solvente, di una soluzione acquosa di dietilammina. Dopo circa un’ora può essere trattato con il rivelatore che consiste in una miscela di ninidrina, etanolo, collidina.

CROMATOGRAFIA SU COLONNA

La colonna

L’attrezzatura di base è la colonna costituita da un tubo di vetro di dimensioni variabili a seconda delle necessità, il corpo centrale viene riempito con la fase fissa delimitata da un setto poroso. È munita di un rubinetto per la fuoriuscita del liquido di trasporto (fase mobile) dalla colon­na verso un recipiente di raccolta a volte collegato con una pompa a vuoto, che rende più veloce il deflusso dei liquidi. La temperatura può essere regolata mediante ca­micie termostatate per l’influenza sui coefficienti di ripartizione e di adsorbimento. Il miscuglio da separare viene depositato in cima alla colonna sottoforma di soluzione, dopo di che si versa dall'alto il liquido di trasporto il quale percola nella colonna verso l'uscita eseguendo un contatto continuo tra la fase mobile e quella fissa.

Cromatografia per adsorbimento

Adsorbenti. Nelle tecniche in adsorbimento la colonna viene riempita con adsorbente, costituito da sostanze solide microgra­nulari, perfettamente essiccate e setacciate in modo da ottenere dimensioni che rappresentano un com­promesso tra l'esigenza di separazione e di non ostacolare eccessivamente il flusso del solvente. Devono essere inerti, nella sostanza adsorbita e nel solvente. La scelta è secondo criteri piuttosto empirici, ma tra i più impiegati vi sono  l'allumina ed il gel di silice.

Solventi. Il solvente ha la funzione di veicolo di trasporto delle sostanze da separare. Deve avere un’adeguata forza solubilizzante ed elevata polarità. È scelto in re­lazione al tipo di adsorbente usato ed alla natura delle sostanze da separare.

Meccanismo di separazione. Il principio di separazione è fondato sull'adsorbimento selettivo delle sostanze da separare sulla fase stazionaria. Ciascuna sostanza è sottoposta all'azione fissatrice dell'adsorbente e a quella trascinante del solvente. Ne risulta un percorso di soste sull'adsorbente e di corse entro il solvente. Le sostanze che ad esempio sono più adsorbite, avranno, mediamente, soste più lunghe e/o più frequenti, col risultato di percorrere la colonna più lentamente. Alla fine, quando il solvente avrà raggiunto l'estremo inferiore della colon­na, le sostanze in esame saranno localizzate ad altezze diverse e tanto quanto maggiore è il potere adsorbente della fase fissa nei loro confronti.

Cromatografia di ripartizione

Fase fissa. È costituita da una sostanza liquida adsorbita su un supporto soli­do granulometrico: ciascun microgra­nulo rimane avvolto da un velo di liquido, ma, per evitare che l'adsorbimento del supporto si eserciti anche sulle sostanze da separare, è bene disattivare il supporto riscaldamento. I supporti più usati sono il gel di silice, l’allumina e la polvere di cellulosa. I liquidi usati per la fase fissa sono in genere di natura polare e, tra questi, l'acqua è di gran lunga la più usata.

Fase mobile. È a scelta in rela­zione alla natura delle sostanze da separare: le sostanze polari richiedono, per la loro eluizione, una fase mobile polare, nel caso che nel miscuglio esista una certa eterogeneità polare, si dovrà operare con solventi diversi in successione, in ordine di polarità crescente, effettuando in gradiente di polarità.



Meccanismo di separazione. Il meccanismo di separazione è del tutto identi­co a quello descritto a proposito dell'adsorbimento, con l'unica differenza che le micro-soste delle molecole nella fase fissa sono dovute alla loro tem­poranea solubilizzazione in questa fase.

Cromatografia a scambio ionico

Fase mobile. Nella cromatografia a scambio ionico la fase mobile è costituita in genere da una soluzione acquosa di sostanze ioniche.

Fase fissa. È costituita da opportune sostanze macromolecolari dette resine scambiatrici, per la presenza nella loro molecola di determinati gruppi che possono scambiare ioni con la fase mobile. Esse vengono distinte in cationiche e anioniche, in relazione al tipo di ioni che vengono catturati.

Le resine cationiche sono dei polimeri contenenti funzioni acide capaci di scambiare il proprio idrogenione con i cationi. Raggiunta la saturazione della resina, si rigenera facendo percolare una soluzione di acido cloridrico che possa rigenerare l’idrogenione.

Le resine anioniche sono polimeri che contengono nella molecola funzioni basiche, generalmente ammine più o meno sostituite, capaci di fissare ioni negativi. Tra i centri attivi delle resine cationiche il gruppo solfonico -SO3H+ è considerato forte, mentre quello carbossilico e fenolico sono considerati più deboli. Analogamente, per le resine anioniche, il gruppo ammonico quaternario tetrasostituito è più forte del monosostituito.

Comportamento

a. Nelle soluzioni acquose diluite ed alla temperatura ambiente, la resina, a parità di carica dei cationi da scambiare, trattiene maggiormente i ca­tioni a numero atomico più elevato. Alle alte concentrazioni può verificarsi l'inversione dei potenziali di scambio.

b. A basse concentrazioni ed in solventi acquosi, sono più facilmente scambiati gli ioni a più elevato numero di carica. Alle alte concentrazioni viceversa.

c. il potenziale di scambio dipende dal tipo di resina alla quale è legato lo ione attivo; ciò è particolarmente valido per gli ioni idrogeno e ossidrile.

d. Il potenziale di scambio corrisponde, grosso modo, al coefficiente di at­tività dello ione.

Dalle considerazioni sopra citate risulta che lo scambio ionico è un fenome­no selettivo.

Tecnica di separazione

La resina viene imbevuta con un po' di solvente, si introduce la soluzione in esame, la resina scambia i propri ioni con quelli della soluzione trattenuti in diverso modo. Introducen­do successivamente l'eluente, i cationi verranno eluiti con una velocità inversamente proporzionale al loro potenziale di scambio. Le singole frazioni eluite possono essere sottoposte a eventuali conferme.

Cromatografia di esclusione

Questa tecnica, nota anche come cromatografia a permeazione di gel (GPC), può essere condotta nella classica colonnina già vista nelle prece­denti tecniche, ma ben si presta a versioni più sofisticate.

Fase fissa. La fase fissa è costituita da un gel di sostanze macromolecolari co­me l'amido, l'agarosio, il polistirene, la poliacrilammide, i polidestrani. Ciascun microgranulo del gel è attraversato da canalicoli che gli conferiscono una notevole porosità determinando le proprietà della fase fissa, decisive ai fini della separazione.

Fase mobile. La fase mobile è costituita da solventi organici, come toluene, cloroformio, dimetilformammide, m-cresolo, trifluoroetanolo, tamponate, peer mantenere il pH, necessario per la separazione, costante.

Separazione. Prevede i seguenti casi:

a. Molecole le cui dimensioni superano il diametro massimo dei pori non possono penetrarvi e vengono trascinate velocemente dal solvente, cioè hanno bassi tempi di eluizione.

b. Molecole le cui dimensioni sono inferiori al diametro minimo dei pori sono completamente permeate e verranno eluite in tempi lunghi.

c. Molecole di dimensioni intermedie verranno parzialmente permeate nel gel e la loro eluizione avverrà in tempi tanto maggiori quanto minori sono le dimensioni molecolari.

Analisi su colonna

In base a qualunque principio sia stata ottenuta la separazione, la colonna contiene le singole sostanze in zone ben distinte (bande) collocate a diffe­rente altezza. Si procede o direttamente all'identificazione delle sostanze in situ, oppure alla loro estrazione dalla colonna mediante l'eluizione o l'estrusione:

Eluizione. Si compie facendo percolare attraverso la colonna solventi atti a portare in soluzione, uno alla volta, ogni singolo componente, avendo cura di raccogliere separatamente gli eluiti.

Estrusione. Si compie estraendo dalla colonna l'intero materiale di riempi­mento (carota) e separando le singole bande mediante una spatola o col­tello. La sostanza, mescolata con la fase fissa, potrà essere  separata mediante estrazione con adatto sol­vente e filtrazione.

Analisi qualitativa

L’ identificazione è si effettua in colonna se le sostanze sono già colorate, altrimenti dopo l’estrusione per sottoporle ad ulteriori controlli analitici per semplici reazioni chimiche che sviluppino colore­ o che producano dei precipitati o per tecniche strumentali come la registrazione di uno spettro UV o IR.

Analisi quantitativa

È sempre richiesta l'eluizione o l'estrusione delle per poi applicare metodi chimici fisici per il dosaggio della sostanza. Essendo la sostanza isolata, non si presentano problemi di interferenze ed il dosaggio potrà risultare accurato. I1 problema, potrà essere quello della sensibilità del me­todo impiegato.




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