Tesina di Biologia Animale - IL GENOMA UMANO

Tesina di Biologia Animale

Oggetto: IL GENOMA UMANO

Il Progetto Genoma Umano (The Human Genome Project) è un progetto internazionale il cui scopo finale è la descrizione completa del genoma umano mediante il sequenziamento, cioè mediante l'identificazione della disposizione delle lettere del codice genetico, lungo tutta la doppia elica del DNA.

Nel progetto sono convogliati sia gli sforzi della ricerca pubblica di molte nazioni, sia quelli di aziende private che operano in maniera centralizzata.

Che cos'è il genoma?

Il genoma è l'insieme di tutte le informazioni genetiche depositate nella sequenza del DNA contenuto

nel nucleo delle cellule sotto forma di cromosomi.

Ogni cromosoma è costituito da un lungo filamento di DNA organizzato in una complessa struttura tridimensionale.

Nel genoma risiedono sia sequenze che non sembrano avere apparentemente una funzione,

il cosiddetto "junk DNA' (DNA spazzatura), come le sequenze fossili che si sono inserite nel nostro genoma milioni di anni fa ma senza assolvere alcun compito, sia geni, cioè le sequenze in cui risiede l'informazione genetica per la sintesi delle proteine, che stabiliscono le caratteristiche peculiari di ogni individuo.

Si stima che nel genoma umano siano presenti circa 50000 geni.

La sequenza del DNA risulta dalla disposizione lineare di quattro molecole differenti,                                   i nucleotidi o basi.

I nucleotidi vengono denominati con i nomi adenina, timina, citosina, guanina e vengono indicati rispettivamente con le lettere maiuscole A, T, C, G.

Un esempio di sequenza potrebbe pertanto essere ATC-TCC-CAG-TTA-GCT, ogni tripletta di nucleotidi corrisponde una determinata informazione per la sintesi delle proteine.

Se una di queste lettere cambia, subisce cioè una mutazione, l'informazione genetica può risultare alterata e le proteine potrebbero non venire più prodotte in modo funzionale causando lo sviluppo di una malattia genetica.

Un esempio di questo fenomeno è la talassemia, causata proprio dalla mutazione in una base del DNA, che conduce alla formazione di un'emoglobina, la molecola che trasporta l'ossigeno, non funzionale.

L'intero genoma è costituito da oltre 3,12 miliardi di queste basi messe in sequenza, e sequenziarlo vuol dire individuare e ordinare ciascuna di queste lettere.

Il genoma è diverso tra individui, ma solo dell'uno per mille, e questa differenza è sufficiente per riflettersi nella variabilità che si osserva non solo tra le persone, ma anche tra i gruppi etnici.

Questo vuol dire che non esiste un genoma universale da sequenziare, infatti il Progetto Genoma Umano intende sequenziare il genoma di un'unica persona e poi andare a ricercare le differenze

tra i vari individui, in particolar modo tra soggetti portatori di determinate malattie e soggetti sani. Questo anche dell'ambito di un ambizioso progetto, quello di ricercare nel DNA la storia dell'evoluzione e delle migrazioni delle popolazioni umane.

Sequenziamento del DNA

Il Progetto Genoma Umano prevede l'analisi del genoma attraverso la tecnica del sequenziamento del DNA.

Il sequenziamento consiste nell'individuare e ordinare tutti i nucleotidi che costituiscono il nostro patrimonio genetico cosi come sono posizionati nel genoma.

Sequenziare vuol dire quindi "leggere' l'ordine in cui sono disposte lungo il DNA le basi, cioè le lettere del codice genetico.

Il sequenziamento costituisce una tappa fondamentale per la comprensione del ruolo delle varie parti del genoma umano, è un "trampolino di partenza" per decodificare il nostro patrimonio

genetico. Infatti il semplice sequenziamento non ci fornisce informazioni direttamente applicabili per

conoscere i meccanismi alla base dei processi fisiologici e patologici dell'uomo, ma rappresenta

uno strumento grazie al quale sarà più semplice in futuro identificare il ruolo delle diverse

porzioni di DNA.

Questo tipo di conoscenze permetterà di identificare le eventuali differenze genetiche tra persone

affette da patologie e persone sane, e in futuro l'individuazione di queste divergenze potrebbe essere utile non solo per diagnosticare una malattia prima dell'insorgenza, ma anche per ideare strategie per curare definitivamente questi soggetti correggendo l'alterazione direttamente a livello del genoma.

Dal punto di vista tecnico per effettuare un sequenziamento, è necessario isolare un frammento di DNA ; Quindi si procede spezzettando i genoma in vari frammenti che vengono inseriti in vettori, sequenze di DNA in grado di ospitare frammenti genici esterni e di permetterne l'amplificazione,

cioè la produzione in grande numero.

A questo punto, isolato un frammento, si procede con il sequenziamento vero e proprio. I metodi di isolamento dei frammenti di DNA sono diversi, e all'interno del Progetto Genoma Umano nell'ambito della ricerca pubblica, i vari laboratori si sono divisi i vari frammenti di cromosomi da sequenziare.

Gli scienziati della Celera Genomics hanno proceduto lavorando su tutto il genoma utilizzando

la tecnica messa a punto per questo scopo da Craig Venter. Questa tecnica è stata denominata

whole genome shotgun sequence technique' e si basa sull'analisi contemporanea dei due filamenti

di DNA che compongono la doppia elica,dopo aver ottenuto dei frammenti dall'intero genoma.

I cromosomi umani vengono frammentati in pezzi, in modo casuale ed inseriti in un vettore plasmidico, cioè un anello di DNA che può essere inserito in batteri del tipo E. coli, in modo che questi ne producano un'elevata quantità (milioni di copie) necessaria per il sequenziamento.

Infine si procede al sequenziamento che viene effettuato da entrambi i lati dei filamenti di DNA

in contemporanea.

La grande mole di dati prodotti con questa tecnica viene infine elaborata da cervelli elettronici molto potenti utilizzando sofisticati programmi di elaborazione dati.

La tecnica del sequenziamento

Isolato il frammento di DNA si procede al sequenziamento vero e proprio.

In questa fase viene utilizzata la DNA polimerasi. La DNA polimerasi è un enzima in gradi di sintetizzare un nuovo filamento di DNA durante il processo di duplicazione, questo processo permette di ottenere due copie del genoma di una cellula prima che questa si divida per generare due cellule figlie.

Inoltre la DNA polimerasi assolve anche funzioni di riparazione del nuovo filamento sintetizzato

in caso di errori di copiatura. In particolare la DNA polimerasi è in grado di sintetizzare un nuovo filamento di DNA partendo da un singolo fiamento al quale è associato un oligonucleotide, denominato

primer.

La DNA polimerasi attacca un nucleotide a questa sequenza copiando in maniera complementare

quella originaria, che funge cosi da stampo. E quindi procede in modo sequenziale fino alla fine del filamento generando una nuova doppia elica.

Reazione a catena della polimerasi

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una procedura mediante la quale è possibile ottenere in tempi estremamente rapidi un gran numero di copie di un frammento di DNA, utilizzando un enzima specifico, la polimerasi e una miscela di nucleotidi liberi. La PCR si svolge in tre fasi.

1. Durante la prima fase, (denaturazione) la molecola di DNA viene riscaldata e scissa nei due filamenti complementari.
2. Nella seconda fase, brevi sequenze di DNA dette promotori o primers, sintetizzate chimicamente, vengono aggiunte nella provetta di reazione; ad una determinata temperatura, i primers si legano in punti specifici di ciascun filamento di DNA. I primers sono indispensabili al passaggio seguente, detto polimerizzazione.
3. Infine nelle terza fase, la polimerasi catalizza il legame delle sequenze primer con nucleotidi liberi; ciò avvia la progressiva formazione di un nuovo filamento di DNA complementare a quello originario. Per ogni ciclo della PCR, dunque, si ottengono due copie identiche del frammento iniziale di DNA; la velocità della reazione è tale che in poche ore vengono sintetizzati cento miliardi di molecole.

Oltre alle basi normali, vengono inseriti anche basi particolari dette disessossinucleotidi, molecole che la DNA polimerasi può attaccare al filamento nascente  del DNA, che formano una specie di "cappuccio" che impedisce l'aggiunta di ulteriori nucleotidi.

Si preparano le diverse miscele di reazione contenenti ciascuna diversi nucleotidi didesossi, che saranno incorporati in modo casuale nel filamento del DNA nascente e della DNA polimerasi, in modo tale generano frammenti di tutte le lunghezze possibili.

I prodotti di questa reazione vengono fatti migrare (attraverso l'utilizzo di un gel) in modo che si separino in modo da separarli in diverse dimensioni. A questo punto si procede con la lettura, che viene effettuata secondo la regola che l'ultimo nucleotidi del frammento deve essere il complementare della base didesossi presente nella reazione (se nella miscela c' è una didesossidenina, l'ultimo nucleotide del frammento deve essere una timina, in quanto l'adenina si associa sempre alla timina).

In questo modo vengono le ultime basi di tutti i frammenti letti nell'ordine costituiscono la sequenza; questo tipo di sequenziamento veniva utilizzato in passato.

Il sequenziamento che viene effettuato al giorno d'oggi è di tipo automatico, non si l'utilizzano più sostanze radioattive, ma nucleotidi colorati.

Il DNA preparato per il sequenziatore automatico viene anch'esso caricato su un gel e fatto migrare,

ma la lettura viene fatta direttamente durante la migrazione grazie ad un lettore ottico collegato ad un computer.

Esistono quindi degli appositi programmi che permettono di trasformare le informazioni visive,

in termini di densità ottica, in informazioni genetiche, e quindi il computer permette di ottenere

direttamente dal gel la sequenza, senza la necessità di un operatore che la legga personalmente.

Le finalità del PGU

A cosa serve il genoma umano?

L'idea del progetto genoma umano è l'acquisizione di conoscenze che potranno essere di grande importanza nel comprendere i meccanismi della genetica umana e l'implicazione dei geni nello sviluppo di malattie umane.

Adesso che il genoma è stato sequenziato e mappato, il prossimo obbiettivo è quello di associare ad ogni sequenza una funzione, considerando che una parte di DNA non ha una funzione vera e propria, ma rappresenta solo "un fossile genetico".

In questo tipo di ricerca hanno avuto un ruolo molto importante i topi knock-out, cioè animali in cui è stato eliminato artificialmente un gene. In questo modo si può osservare cosa accade in mancanza di determinati geni e si può cosi dedurre la funzione delle proteine prodotte dai vari geni;  questo è possibile grazie all'elevata somiglianza che esiste tra i geni dell'uomo e quelli del topo e di altri animali da laboratorio.

La conoscenza del genoma umano permetterà di capire e approfondire la natura genetica dei fenomeni biologici nell' uomo in particolare quelli patologici, permettendo di ideare terapie più efficaci, o dove è possibile procedere con la terapia genica.

La storia del progetto

Nel 1983 i due più importanti laboratori per lo sviluppo della genetica umana in relazione allo sviluppo delle armi nucleari, a Los Alamos e a Livermore, cominciarono a lavorare al Progetto Biblioteca Genetica. In particolare la DOE (US Department of Energy) era interessata agli effetti delle mutazioni nell'ambito dei programmi nucleari civili e militari.

Nel Dicembre 1984 ad Alta, nello Utah durante un convegno sponsorizzato dalla DOE, il cui scopo era valutare l'efficacia delle tecnologie utilizzate per identificare le mutazioni, si avanzò l'ipotesi che per poter identificare ad alta efficienza le alterazioni nella sequenza del DNA era necessaria l'impostazione di un progetto molto complesso e costoso. Il biologo Robert Sinsheimer propone di fondare un istituto per studiare la sequenza del genoma.

Nel Marzo 1986 la DOE sponsorizza un altro convegno, a Santa Fe, in New Messico, in cui viene evidenziata l'importanza della necessità e della fattibilità di ordinare e sequenziare tutti i frammenti di DNA del genoma umano isolati fino a quel momento, e di continuare a individuarne altri. Dulbecco scrive un articolo su Science in cui riporta la necessità di conoscere la sequenza dei geni per poter sconfiggere il cancro e capire molti fenomeni biologici.

1987 la DOE pubblica Report on the Human Genome Initiative: in questa pubblicazione vengono individuati tre fronti che dovevano essere potenziati:

- la realizzazione di mappe fisiche dei cromosomi umani;

- lo sviluppo di tecnologie di supporto per la ricerca sul genoma umano;

- il potenziamento della divulgazione delle informazioni, e in particolare la realizzazione di un apposito software di database;

- 1988 la US Office of Technology Assessment e il National Research Council pubblicano diversi articoli in merito;.

- 1988 l'NIH (US National Institutes of Health) istituisce un organo competente per questa materia

all'interno della sua organizzazione, l'Office of Human Genome Research (poi rinominato come National Center for Human Genome Research);

- 1988 il Congresso americano approva in via ufficiale il Progetto Genoma Umano della durata di 15 anni con inizio nel 1991. Inizialmente si stimò che sarebbero serviti 15 miliardi di dollari;

- 1999: nel corso dell'anno Celera Genomics, una società privata americana, fondata da Craig Venter impegnata in ricerche di genetica, presenta 6500 richieste di brevetti;

- dicembre 1999: su Nature viene pubblicata la sequenza completa del cromosoma 22, uno

dei più piccoli fra i cromosomi. A completarne il sequenziamento sono stati gli scienziati del Sanger Center, il centro di ricerca che si stima stia effettuando quasi un terzo di tutto il lavoro del settore pubblico all'interno del Progetto Genoma Umano (The Sanger centre (Gb);

- 10 gennaio 2000: Greg Venter annuncia che la Celera Genomics ha sequenziato e archiviato le sequenze di diversi frammenti di genoma che, secondo i loro calcoli, dovrebbero coprire il 90% del genoma umano;

- 24 Marzo 2000: su Science esce la sequenza completa del Genoma di Droso_la Melanogaster, da parte della Celera Genomics, in collaborazione con gli scienziati del Berkeley Droso_la Genoma Project (BDGP). Durante il progetto di sequenziamento hanno identificato 14000 geni.

- Giovedì 6 aprile 2000: (Nature Biotechnology) annunciò il completamento del sequenziamento del genoma umano da parte della Celera Genomics. Hanno completato il sequenziamento,e completeranno la mappatura entro l'anno. Il genoma umano si è rivelato composto da 3,12 miliardi di coppie di basi nucleotidiche. Il sequenziamento è stato effettuato sequenziando dei frammenti di DNA ottenuti dal genoma; sono state sequenziate oltre 14 miliardi di basi;

- 10 aprile 2000: su Nature, annuncia il completamento del sequenziamento del 99,7% del Cromosoma 21, il più piccolo dei cromosomi, la cui presenza in 3 copie causa la Sindrome di Down.

- 26 Giugno 2000: Conferenza stampa alla Casa Bianca di Clinton con i rappresentanti della Celera Genomics per annunciare il completamento di una bozza della sequenza del genoma in cui sono già riportate le localizzazioni di molti geni sui cromosomi. Il lavoro di assembramento delle sequenze nucleotidiche è stato effettuato grazie all'utilizzo di computer per un totale di 20000 CPU;

Nel febbraio 2001, i due competitori pubblicano indipendentemente una prima sequenza di DNA umano.

Nel 2003 presentano entrambi, indipendentemente, le sequenze finali, che però differiscono tra di loro, e il dibattito sulla validità delle tecniche impiegate e sulla qualità delle sequenze ottenute è ancora in corso.

Dati attuali

Al 25 Aprile 2006, secondo il Genomes OnLine Database risultano:

-1964 progetti genomici;

- 373 genomi completi pubblicati;

- 56 genomi archaeal in corso;

- 942 genomi bacterial in corso;

- 607 genomi eukaryotic in corso;

Chi partecipa al progetto?

Collaborano al Progetto Genoma Umano circa 50 nazioni. Gli Stati Uniti, che sono i maggiori

contribuenti, molte nazioni hanno creato dei propri programmi di ricerca. Le prime nazioni coinvolte sono state il Regno Unito, e la Francia, quindi la Danimarca, la Germania, l'Italia, l'Olanda.

Tra i primi ad appoggiare il progetto va annoverato il Giappone. Partecipano inoltre anche URSS, Australia, Canada, Korea, Nuova Zelanda. Per coordinare i lavori di tutte le nazioni è stato fondata nel 1988 l'Human Genome Organization (HUGO), che ha attualmente tre sedi: HUGO Europa (Londra), HUGO America (Bethesda, USA), HUGO Pacifico (Tokyo).

Per quanto riguarda l'Italia, ha partecipato al Progetto Genoma Umano dal 1988 al 1995; il coordinamento era stato affidato a Renato Dulbecco. Rispetto agli altri paesi, lo stanziamento per la ricerca in Italia era minimo, circa 16 miliardi di lire, cioè 270 volte meno che negli Stati Uniti, 42 volte meno che in Giappone, 40 volte meno rispetto della Germania.

Nel 1995 i finanziamenti pubblici al progetto genoma in Italia si interrompono. La ricerca Italiana sul genoma prosegue oggi soprattutto grazie ai finanziamenti privati, principalmente quelli di Telethon che, con i suoi finanziamenti alla ricerca ha contribuito all'identificazione di numerosi geni-malattia, tra cui quelli responsabili di malattie, come la paraplegia spastica ereditaria, l'albinismo oculare e diverse forme di distrofia muscolare, ma anche patologie più comuni, come la sordità ereditaria e l'emocromatosi.

Dove si trovano i risultati?

I risultati ottenuti dal sequenziamento del genoma umano vengono inseriti in un database a cui tutti possono accedere.

I ricercatori che partecipano a questo progetto, nell'ambito del finanziamento pubblico, hanno l'obbligo di inserire i risultati ottenuti nel database entro 24 ore dalla scoperta. Questi programmi sono  strutturati in modo da permettere delle ricerche in base al nome del gene, ad un tratto di sequenza, al nome della proteina e cosi via. Basta immettere i dati che si conoscono, e il computer ricerca nell'archivio (database) le informazioni note sull'argomento richiesto.

Si possono ottenere le sequenze complete dei geni identificati, con la sequenza proteica corrispondente, l'identificazione delle sequenze particolari e delle sequenze consenso, cioè quelle

sequenze che codificano per porzioni proteiche che rivestono dei ruoli particolari, e si possono ritrovare in diverse proteine.

A chi appartiene il genoma umano?

L'interesse di molte società private per il Progetto Genoma Umano, deriva dalla possibilità di sfruttare economicamente il sequenziamento del DNA, previo ottenimento del brevetto dei frammenti.

Dal 1981 al 1995 il numero di brevetti concessi in tutto il mondo, sono stati 1175 (di cui solo il 17% appartiene ad enti pubblici) contro i 6105 richiesti.

Alla fine del 2001 sono stati richiesti oltre 3 milioni di brevetti.

I brevetti vengono concessi in base a 4 caratteristiche.:

L'inventore deve aver identificato una sequenza genetica nuova,

deve specificare il ruolo di questa sequenza;

la funzione di questa in natura,

deve descriverla in modo che un altro specialista del campo possa utilizzarla per i propri scopi;

Secondo il parere dell'HUGO, si oppone alla concessione di brevetti e ribadisce il concetto che solo l'immediata pubblicazione delle sequenze scoperte permette la libera diffusione delle conoscenze, alla base della cooperazione internazionale fondamentale per l'avanzamento scientifico.

Il parere del CNB italiano

Il CNB (Comitato Nazionale per la Bioetica) italiano ha espresso il seguente parere sul Progetto Genoma Umano; in particolare ai rischi concessi al rilascio di brevetti in campo genetico sono molteplici:

Innanzitutto possono interferire con lo sviluppo di mezzi terapeutici e diagnostici a causa

dei costi associati all'uso dei dati coperti da brevetto;

I prodotti derivanti da una sequenza brevettata hanno costi maggiori, in quanto il produttore deve ammortizzare gli elevati costi derivanti dl brevetto;

Infine mettono in discussione un problema chiave di questo progetto: se è giusto brevettare un elemento appartenente alla natura e in particolare a noi stessi.

Bibliografia:

www.torinoscenza.it

www.geocities.com/codadilupo_2000/genoma.htm

www.genomesonline.org

www.celera.com

www.anisn.it/scuola/strumenti/genoma/Genoma.ppt

www.scienzita.it/articoli/biologia/celera_dna_2000.htm

Davies K., 2001. 'Il codice della vita' Ed. Mondadori, Milano.

Borgna P. 2001. "Immagini pubbliche della scienza. Gli italiani e la ricerca scientifica e tecnologica", Ed. Comunità, Torino.