Gli anticorpi

Gli anticorpi

A Kabat si deve il merito di avere scoperto in quale frazione sierica risiede la funzione anticorpale. Egli condusse un esperimento: prese un coniglio e lo immunizzò (immunizzare vuol dire induzione deliberata di una risposta immunitaria) con un antigene (che rappresenta qualsiasi sostanza estranea con cui veniamo in contatto; le sue due caratteristiche principali sono:

l'immunogenicità, ovvero la capacità di allestire una risposta immunitaria; questa caratteristica necessita di una serie di qualità come: estraneità, peso molecolare, eterogenicità chimica, degradabilità

l'antigenicità, cioè la capacità che hanno le nostre difese di reagire contro l'antigene.

Dopo avere immunizzato il coniglio, quindi, prelevò un po' del suo sangue, lo centrifugò, prese il siero e lo mise da parte. Successivamente prese un coniglio della stessa specie, NON immunizzato questa volta, e ancora una volta prelevò il sangue, centrifugò e tolse via il siero. Allora sottopose questo siero all'analisi dell'elettroforesi (che rappresenta la migrazione delle proteine nel campo elettrico) e separò le frazioni proteiche in α, β e γ globuline.

Confrontando le elettroforesi del siero immunizzato (cioè il siero del coniglio che era stato precedentemente stimolato con l'antigene) con quello preimmune (fig.1 quaderno), si accorse di una cosa sorprendente: la frazione anticorpale risiedeva nelle γ globuline in quante esse presentavano una concentrazione anticorpale molto alta. Per controprova precipitò gli anticorpi del siero con solfato di ammonio e attraverso l'elettroforesi notò che la frazione γ era esattamente uguale a quella del siero preimmune. Quindi con il termine di anticorpo, che possiamo anche chiamare con termini diversi quali "γ-globuline" o più in generale "immunoglobuline" (visto che nella porzione γ sono presenti diverse proteine), si intende quelle glicoproteine plasmatiche la cui sintesi può essere indotta dall'introduzione di un antigene che è in grado di stimolare le difese immunitarie a dare una risposta specifica. Gli anticorpi sono dotati della proprietà fondamentale di reagire specificamente con l'argento. Il merito di avere individuato la struttura della nostra molecola anticorpale si deve a Porter e ad Edelmann i quali utilizzarono due procedimenti, uno un procedimento enzimatico ed l'altro un procedimento chimico: entrambi arrivarono allo stesso risultato. Presero la frazione delle γ-globuline, la sottoposero a ultracentrifugazione ed ottennero due frazioni: una a basso peso molecolare con costante di sedimentazione 7-8 S, l'altra ad alto peso molecolare con costante di sedimentazione 19 S. Per i loro studi presero la frazione più piccola e la chiamarono con il nome IgG (ovvero immunoglobulina della porzione γ). Porter si avvalse del procedimento enzimatico ed utilizzò la papaina che è un enzima protelitico. Questa agì sopra il ponte disolfuro tagliando la nostra molecola anticorpale in tre parti: due frammenti Fab (Fragmente, antigen bindin perché reagisce legando l'antigene) ed un frammento Fc (Fragment cristallizable perché cristallizza a basse temperature). La prima volta l'esperimento fallì in quanto tenne la frazione γ troppo a lungo con la papaina e questa digerì tutto. Un altro enzima da utilizzare al posto della papaina è la pepsina che agisce invece al di sotto del ponte disolfuro: con questo metodo, però, si ottiene un grosso frammento chiamato Fab2 (poiché due Fab sono uniti dal ponte disolfuro) e la porzione Fc viene ridotta in tanti piccoli frammenti.

Edelmann, invece, si avvalse di procedimenti chimici: denaturò questa porzione piccola a basso peso molecolare con il β-mercaptoetanolo dopodiché la fece correre in un gel di acrinamide ed ottenne la distensione della molecola. Porter ripetè l'esperimento di Edelmann con il β-mercaptoetanolo, alchilò la molecola con lo iodioacetamide (per impedire che si ricompattassero i legami disolfuro) e poi sottopose questa frazione della molecola anticorpale a cromatografia su colonna. Questo test separò la molecola anticorpale in catene, in base al peso molecolare: due catene leggere e due catene pesanti.

Che relazione c'è fra l'esperimento fatto prima da Porter e quello fatto poi da Edelmann?

Per potere intuire dalla risposta questa domanda prese le frazioni Fab e le frazioni Fc ed immunizzò la capra con esse. Ovviamente nella capra si sono andati a generare anticorpi anti-Fab ed anticorpi anti-Fc e vide che gli anticorpi anti-Fab riconoscevano l'intera catena leggera e metà della catena pesante, mentre gli anticorpi anti -Fc riconoscevano solo la parte finale della catena pesante. A questo punto la struttura monomerica di tutte le immunoglobuline era pronta: quindi la molecola anticorpale è costituita da due catene pesanti e due catene leggere; nell'ambito delle catene leggere e delle catene pesanti distinguiamo la porzione Fab e la porzione Fc. A questo punto si cerco il sito "binding" in cui l'antigene va a reagire con la nostra molecola anticorpale. La determinazione della sequenza aminoacidica degli anticorpi non fu facile perché nel siero essi sono eterogenei e presenti in numero elevatissimo. La cosa fu possibile, dopo qualche anno perché fu scoperto un tumore: il mieloma multiplo. Il mieloma multiplo è il tumore della plasmacellula cioè della cellula differenziativa del linfocita B. La plasmacellula va a produrre gli anticorpi. Le plasmacellule tumorali, per distinguerle dalle plasmacellule normali, vengono chiamate cellule mielomatose. Anche le cellule mielomatose producono delle proteine, che sarebbero gli anticorpi tumorali che chiamiamo proteine mielomatose per distinguerle dagli anticorpi normali. Una proteina mielomatosa è identica all'anticorpo solo che il mieloma produce tutte immunoglobuline uguali.

Il mieloma fu creato in laboratorio (plasmocitoma) nel topo introducendo nella cavità peritoneale degli oli minerali ed immunizzando il topino con un antigene A noto al ricercatore. A questo punto conosciamo la specificità e sappiamo che le proteine mielomatose sono specifiche per quell'antigene A. Nelle persone affette da mieloma sono state trovate nelle urine delle catene leggere che prendono il nome di catene di Beige-Johnes. Quindi abbiamo detto che costruendo il plasmocitoma conosciamo la specificità: hanno costruito plasmocitoma indotto da antigene A, da antigene B, da antigene C e da antigene D. In base all'antigene venivano poi prodotti vari anticorpi: anticorpi anti-A, anti-B, anti-C, anti-D. Dallo studio studio dei plasmocitomi si è notata una cosa sorprendente: i primi 110 aminoacidi delle catene leggere trovate nelle urine erano diversi, gli altri 110 aminoacidi, invece, erano tutti uguali (dunque riassumendo diciamo che nell'ambito delle catene leggere metà della catena leggera presenta una sequenza aminoacidica diversa da catena a catena mentre l'altra metà è identica in tutte le catene. Volendo fare una analogia con le parole: psicologia, fisiologia, immunologia, patologia. queste sono parole con una matrice diversa ed una uguale. Quello che ne consegue è che nell'ambito della catena leggera abbiamo una regione variabile ed una regione costante.

Le catene leggere sono delle proteine formate da 220 amminoacidi e presentano una regione variabile ed una regione costante. Studiando ancora le catene leggere si è vista ancora un'altra cosa: nella porzione costante, che è identica cioè in tutte le catene, si sono evidenziate due tipi di catene κ e λ. Per il 70% le nostre catene sono di tipo κ, per il 40% sono invece di tipo λ. Ancora nell'uomo nell'ambito della catena leggera λ si sono riscontrati altri 4 sottotipi (pensate che queste catene si distinguono tra loro soltanto per uno o due amminoacidi); i sottotipi della catena leggera λ sono: λ1, λ2, λ3, λ4. È importante notare che non esistono catene leggere ibride cioè del tipo κ λ ma devono essere entrambe di tipo κ o di tipo λ. Quindi in seguito alla stimolazione antigenica nei confronti dell'antigene A si sviluppa il clone-1 che produrrà anticorpi anti-A e svilupperà delle catene leggere per esempio di tipo κ e gli anticorpi prodotti da questo clone sono identici. Se noi immunizziamo con l'antigene B si sviluppa il clone-2 che produrrà anticorpi anti-B; chiaramente gli anticorpi anti-B si differenziano dagli anticorpi anti-A in quanto la regione variabile sarà diversa mentre la regione costante resterà uguale (primi 110 aminoacidi saranno diversi, ma la parte costante, la porzione Fc, sarà uguale).

Le catene pesanti sono delle glicoproteine e sono dette "pesanti" perché hanno il doppio degli amminoacidi rispetto alle catene leggere e quindi 440 amminoacidi. Nell'ambito delle catene pesanti abbiamo 5 classi: α, γ, δ, ε, μ. Queste contraddistinguono le classi anticorpali e rispettivamente: IgA, IgG, IgD, IgE ed IgM ognuna portante una diversa catena. Queste classi si contraddistinguono per un bel numero di amminoacidi. In queste classi si distinguono anche delle sottoclassi: due per le IgA (IgA₁ e IgA₂) e quattro per le IgG (IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄). Le catene pesanti, come abbiamo detto sono delle glicoproteine e presentano dei radicali carboidratici. Questi radicali svolgono ben 4 funzioni:

mantengono la molecola anticorpale nella giusta conformazione;

proteggono alcuni classi anticorpali dall'azione degli enzimi proteolitici;

favoriscono la sintesi dell'anticorpo;

favoriscono il catabolismo della molecola anticorpale da parte di cellule epatiche che presentano dei recettori per l'Fc.

Nell'ambito delle catene aminoacidiche, sia delle catene leggere sia delle catene pesanti, sono state viste delle particolari regioni dotate di autonomia, tanto che sono state chiamate domini.

Nelle catene leggere troviamo un dominio Variabile ed un dominio Costante; nelle catene pesanti distinguiamo un dominio Variabile e quattro domini Constanti; ognuno di questi domini ha una funzione ben precisa.La catena pesante con la catena leggera sono tenute insieme da legami disolfuro intracatena. Ogni dominio è costituito da 100-110 amminoacidi e in una determinata posizione ogni dominio presenta residui di cisteina distanziati da 60 amminoacidi. Tra i due residui di cisteina si stabilisce un legame disolfuro intracatena. Ciò permette di dare origine al loop (conformazione ad anello).

L'analisi cristallografica del dominio ha rivelato una situazione molta complicata: ogni dominio è formato da due foglietti β-planari antiparalleli; in questi foglietti c'è un'alternanza di amminoacidi idrofobici (che si trovano all'interno) ed idrofilici (che si trovano all'esterno). Questi due foglietti sono stabilizzati da diverse interazioni idrofobiche e da un unico legame disolfuro. Se facciamo un analogia con il tramezzino possiamo dire che i due foglietti β sono le due fette di pancarrè, il condimento rappresenta le interazioni idrofobiche e lo stuzzicadenti rappresenta invece il ponte disolfuro.

Come più volte si è ripetuto nel corso del documento, nell'immunoglobulina abbiamo individuato una regione costante ed una regione variabile. La variabilità non è segregata all'intera regione variabile ma nell'ambito del dominio variabile, sia della catena pesante, sia della catena leggera, sono presenti delle regioni relativamente variabili, chiamate "frame wall" (che in italiano vuol dire cornice), che rappresentano lo scheletro del dominio variabile (le frame wall sono 4). Ancora nell'ambito delle catene pesanti e leggere sono presenti 3 regioni altamente variabili, regioni "Ipervariabili", le quali trovano perfetta complementarietà con gli epitopi antigenici e prendono il nome di CDR. Il significato di tutto ciò è che nella regione variabile esiste il sito combinatorio dove l'antigene si va a collocare. Il CDR3 è quello più variabile di tutti!

Il primo dominio costante della catena leggera (C_L1) e il primo dominio costante della catena pesante (C_H1) hanno la funzione di allargare le braccia della molecola anticorpale per favorire una migliore interazione con l'antigene. Tra il dominio C_H1 e il dominio C_H2 si nota una struttura strana chiamata "regione cerniera". Questa regione cerniera è formata a seconda della classe anticorpale da un numero di amminoacidi che varia da 10 a 60 ed è ricca di residui di prolina. Questi residui conferiscono all'anticorpo una certa mobilità. Dobbiamo pensare quindi che un lato della molecola anticorpale si è responsabile del riconoscimento dell'anticorpo mentre l'altro lato è responsabile delle funzioni dell'anticorpo: la porzione Fc è responsabile della funzione effettrice dell'anticorpo. Le regioni variabili, vedremo, si possono associare a diverse porzioni Fc. Il dominio C_H2 delle IgA, delle IgG e delle IgD ha la funzione di attivare il complemento; l'IgM e le IgE mancano della regione cerniera ma hanno un dominio aggiuntivo (solo esse hanno 4 domini costanti mentre IgA, IgG, IgD hanno 3 domini costanti): il dominio C_H2 svolge la funzione della regione cerniera e il dominio C_H3 (nelle IgM e nelle IgE) ha funzione di attivare il complemento. Il dominio C_H3 nelle IgA, IgG e nelle IgD ha la funzione, invece, ha la funzione di potenziare la fagocitosi. Il dominio C_H4 nelle  IgM e nelle IgE svolge la funzione di potenziare la fagocitosi.